使用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取時(shí)常常會(huì)遇到質(zhì)粒濃度低，質(zhì)粒提取效果不理想等問題，那么提取質(zhì)粒濃度低的原因有哪些呢？

一、細(xì)菌離心后，加入溶液蝸旋振蕩時(shí)，發(fā)現(xiàn)菌體呈絮狀不易混勻，或成細(xì)砂樣。

   很可能是細(xì)菌發(fā)生溶菌，可減少培養(yǎng)時(shí)間、降低培養(yǎng)溫度試試看，通常降低培養(yǎng)溫度 會(huì)使細(xì)菌生長更加穩(wěn)定；同時(shí)也可以試試平板培養(yǎng)，培養(yǎng)后，用PBS將菌落洗下，再進(jìn)行質(zhì)粒的提取，固體培養(yǎng)基上細(xì)菌生長的要好一些。

二、加入溶液Ⅱ，菌液渾濁度沒有發(fā)生明顯變化。

    裂解不完全，主要問題是發(fā)生在溶液Ⅱ上。確保10%SDS是澄清的，確認(rèn)NaOH是有效的，如使用的是試劑盒，確認(rèn)溶液I是澄清沒有沉淀的。如確認(rèn)原因不是發(fā)生在溶液II上，而是細(xì)菌濃度比較高，可相應(yīng)增加溶液I/III的體積。此外，還有可能是"雜菌"污染。

三、加入酚仿抽提，離心后在水相和有機(jī)相間沒有變性蛋白層，但隨后的乙醇沉淀發(fā)現(xiàn)大量的半透明沉淀，溶解后蛋白濃度高。

   乙醇沉淀時(shí)，較純的質(zhì)粒沉淀應(yīng)該是白色（PEG純化的沉淀是透明的，肉眼不易發(fā)現(xiàn)），如沉淀是半透明的凝膠狀，則是蛋白含量高。出現(xiàn)此類問題時(shí)確認(rèn)兩點(diǎn)∶

1.平衡酚是否被氧化、pH是否是8.0。

2.溶液III/Ⅲ反應(yīng)后，離心的上清pH是否在8.0左右。有時(shí)，由于溶液Ⅲ配置的問題，導(dǎo)致溶液I/IIL反應(yīng)后離心的上清pH與8.0偏差較大，導(dǎo)致平衡酚抽提時(shí)沒有有效的將蛋白抽提出來，有時(shí)，離譜的pH會(huì)導(dǎo)致水相和平衡酚互溶。

四、使用酚仿抽提方法，質(zhì)粒A260/A280的純度也很好，但酶切不能完全切開。

1.確認(rèn)酶的有效性；

2.平衡酚是否被氧化而呈現(xiàn)棕色，而非正常的黃色；

3.是否不小心吸入了痕量的酚；

4.乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分，殘留的鹽類會(huì)影響酶切；

5.乙醇漂洗后是否完全干燥，殘留的乙醇會(huì)影響酶切；

五、 提取質(zhì)粒中RNA沒有去除。

主要原因是RNase失效，或效率不高。

建議∶1.更換RNase A，并保證其儲(chǔ)存條件是正確的；

2. 對(duì)于手工提取質(zhì)粒，可單獨(dú)增加一步去處RNA的步驟，即溶液Ⅲ反應(yīng)后，離心的上清中加RNase，室溫37度去RNA10min~30min，但需要保證你的RNase A是經(jīng)過失活DNase的，同時(shí)較高溫度（如50度）會(huì)更加快速完全的去除RNA，但本人經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)過高溫處理的質(zhì)粒質(zhì)量也不高。

六、傳統(tǒng)手工大提質(zhì)粒，使用PEG8000純化的問題。

     A .PEG8000不需要滅菌，當(dāng)然，你要確認(rèn)你的PEG8000是分子生物學(xué)使用級(jí)別（我們一直使用的SIGMA的）；

B.如果PEG8000純化后的得率很低，需要確認(rèn)一下∶加入PEG8000前，質(zhì)粒溶液是否是TE，而不是含有大量其它雜鹽得溶液。在PEG8000純化前，質(zhì)粒溶液應(yīng)該是經(jīng)過乙醇或異丙醇沉淀，且經(jīng)過70%乙醇漂洗過的；沉淀步驟應(yīng)在冰上或4度進(jìn)行。

C. 關(guān)于PEG8000處理后離心看不見沉淀的問題∶PEG8000的沉淀是透明的，有時(shí)可以看到沉淀，而有時(shí)很難辨出沉淀

七、 試劑盒提取質(zhì)粒也會(huì)成為提取質(zhì)粒濃度低的原因。

     檢查漂洗液，是否配置太久，而且在使用后沒有旋緊蓋子。

八、培養(yǎng)基、抗生素、質(zhì)粒提取都沒有問題，而細(xì)菌菌液提取不到質(zhì)粒。

        可以使用細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒。

九、 原先測(cè)序鑒定沒有問題的細(xì)菌，37度搖菌后發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒大小或序列出現(xiàn)異常。————這種情況出現(xiàn)的幾率較小。常出現(xiàn)在較大質(zhì)?；虮容^特殊的序列中。

解決辦法∶

a.降低培養(yǎng)溫度，在20~25度下培養(yǎng)，或室溫培養(yǎng)可明顯減少發(fā)生概率；

b.使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重組酶，如rec類等，使得質(zhì)粒復(fù)制更加穩(wěn)定。

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