堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶和β-半乳糖苷酶是ELISA中很少使用的酶。

ELISA 在原理上類似于放射免疫測定 (RIA)，但更安全且成本較低。

ELISA 有助于抗原或抗體的定性（存在或不存在）和定量（濃度）測量。

當前使用的酶聯(lián)免疫分析技術主要有以下幾種：

1.直接ELISA

直接和間接 ELISA 都從將抗原包被到 ELISA 板上開始。

步驟：

•   將抗原添加到板中，在 37 攝氏度下孵育一小時或在 4 攝氏度下孵育過夜。
•   孵育步驟完成后，下一步是清洗任何潛在未結合抗體的板，并使用 BSA、卵清蛋白、抑肽酶或其他動物蛋白等試劑封閉 ELISA 板上任何未結合的位點。
•   這一步很重要，因為它可以防止任何非特異性抗體與板結合，并盡可能地減少假陽性結果。添加緩沖液后，重新洗滌板，并添加選定的 酶聯(lián)檢測一抗 。將板進一步溫育一小時。
•   在直接 ELISA 中，主要檢測抗體直接與感興趣的蛋白質結合。
•   接下來，重新洗滌板以去除任何未結合的抗體，然后向板中添加底物/發(fā)色團，例如堿性磷酸酶 (AP) 或辣根過氧化物酶 (HRP)，從而導致顏色變化。樣品的顏色變化是通過 AP 從底物中水解磷酸基團或通過 HRP 氧化底物而發(fā)生的。

  使用直接 ELISA 的優(yōu)勢主要是消除二抗交叉反應，并且由于步驟更少，與間接 ELISA 相比速度更快。它的缺點包括與其他類型的 ELISA 相比靈敏度低，反應成本高。

2. 間接 ELISA

    間接 ELISA 的步驟與直接 ELISA 相同，除了額外的洗滌步驟和去除緩沖液后添加的抗體類型。間接 ELISA 需要兩種抗體，一種是粘附在目的蛋白上的檢測一抗，另一種是與一抗互補的酶聯(lián)二抗。

    開始需要加入一抗，然后進行洗滌步驟，再加入酶聯(lián)二抗并孵育。此后，步驟與直接 ELISA 相同，包括洗滌步驟、添加底物和檢測顏色變化。

簡要步驟如下：

• 將含有一抗 (Ab1) 的樣品添加到抗原包被的微量滴定孔中，然后附著在孔中的抗原與 Ab1 發(fā)生反應。
• 未結合或游離的 Ab1 都被洗掉，酶標二級抗體 (Ab2) 被添加到微量滴定孔中。
• 與酶偶聯(lián)的二抗與一抗結合。
• 游離或未結合的 Ab2 都被洗掉，并添加酶的特定底物。
• 形成的有色反應產物的量的測定主要由紫外分光光度計、酶標儀、微孔板讀板機等儀器來完成。

       間接 ELISA法也常用于檢測血清中是否存在抗 HIV 抗體。與直接 ELISA 相比，間接 ELISA 具有較高的靈敏度，反應成本較低，這種類型的 ELISA 的主要缺點是二級檢測抗體之間存在交叉反應的風險。 

3.  酶聯(lián)免疫吸附試驗-夾心式elisa

與直接和間接 ELISA 不同，夾心 ELISA 從包被到板孔上的捕獲抗體開始。因為抗原夾在兩層抗體（捕獲抗體和檢測抗體）之間，所以也稱為“三明治”。

   流程如下：將捕獲抗體添加到板中后，將板蓋上并在 4°C 下孵育過夜。包被步驟完成后，用 PBS 清洗板，然后用 BSA緩沖/封閉。緩沖液洗滌在室溫下進行至少 1-2 小時。末了，在加入抗原之前用PBS再次洗滌板。

   然后將目標抗原添加到板中以與捕獲抗體結合并在 37 攝氏度下孵育 90 分鐘。重新清洗板，然后將檢測一抗添加到板中并再孵育 1 至 2 小時在室溫下，然后用緩沖液清洗。然后加入酶聯(lián)二抗，再孵育 1 至 2 小時。重新清洗板，加入底物以產生顏色變化。夾心 ELISA 在所有 ELISA 類型中具有具有較高的靈敏度。夾心式elisa 的主要缺點是會耗費較多的時間和費用，另外這種ELISA 方法，必須要使用配對的抗原（二價/多價抗原）和二抗。

簡略步驟如下：

• 使用夾心式elisa，抗體被固定在微量滴定孔中，而不是抗原。
• 添加含有待檢測或測量的抗原的樣品并使其與固定化抗體反應。
• 清洗孔并加入對抗原上不同表位具有特異性的第二種酶聯(lián)抗體，并使其與結合的抗原反應。
• 通過洗滌去除任何游離的二抗后，加入酶特異性底物。
• 這稱為夾心 ELISA，因為待檢測的抗原夾在兩種抗體（結合抗體和酶聯(lián)抗體）之間。
• 末了，通過分光光度計、酶標儀等實驗室儀器使用分光光度法來測定有色反應產物。

4. 酶聯(lián)免疫吸附試驗-競爭性 ELISA

  競爭性 ELISA方法主要用于檢測血清中是否具有特異性的抗原/抗體。這種類型的 ELISA 會使用兩種特異性抗體，一種酶聯(lián)抗體和另一種存在于測試血清中的抗體（如果血清呈陽性）。將兩種抗體結合到孔中將允許競爭結合抗原。顏色變化的存在意味著測試是陰性的，因為酶結合抗體結合了抗原（而不是測試血清的抗體）。沒有顏色表明測試呈陽性，并且測試血清中存在抗體。

     該技術中，需要將抗體與溶液形式的抗原（在樣品中）一起孵育，然后將該混合物添加到抗原包被的微量滴定孔中。樣品中存在的抗原越多，可用于結合抗原包被孔的游離抗體就越少。添加對一抗同種型具有特異性的酶偶聯(lián)二抗 (Ab2) ，用于確定與孔結合的一抗數(shù)量，如在間接 ELISA 中一樣。

    競爭性 ELISA 特異性低，不能用于稀釋樣品。然而，好處是需要的樣品純化較少，它可以測量給定樣品中的大范圍抗原，可用于小抗原。然而，需要注意的是在該技術中，原始樣品中抗原的濃度越高，吸光度越低。 

 酶聯(lián)免疫吸附試驗 ELISA的應用：

1.檢測和測量給定樣品中的抗原或抗體。（自身抗體：抗 dsDNA、抗 dsg1、ANA 等；傳染病抗體：抗菌、抗病毒、抗真菌；甲型、乙型、丙型肝炎、艾滋病毒等）

2.檢測和估計腫瘤標志物的水平：比如：前列腺特異性抗原 (PSA)、癌胚抗原 (CEA)

• 檢測食品樣品中的潛在過敏原。
• 用于某些類別藥物的快速推定篩選。
• 肽、抗體、激素、蛋白質等物質的檢測和定量
• 外泌體檢測、細胞外囊泡檢測等

 影響酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA結果的因素有哪些？

主要包括檢測板、包被緩沖液、捕獲抗體、封閉緩沖液、靶抗原、檢測抗體、酶偶聯(lián)物、洗滌液、底物、信號檢測的質量和完整性都會干擾正確的 ELISA 測試。一些可能干擾測試的因素如下：

1.微孔板：孔的形狀和質量、板的材料、潛在的預激活、均勻或不均勻的涂層

2.緩沖液：pH、污染

3.捕獲和檢測抗體：孵育時間、溫度、特異性、滴度、親和力

4.封閉緩沖液：交叉反應、濃度、污染

5.靶抗原：構象、穩(wěn)定性、表位

6.酶結合物：類型、濃度、功能、交叉反應

7.清洗：污染、頻率、體積、持續(xù)時間、成分

8.基板：微孔板的質量、材質

9.檢測：檢測相關的儀器設備：比如：分光光度計、讀板機等相關因素

10. 誤差：人為誤差（實驗步驟不規(guī)范等）

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