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標簽：抗體 親和層析 蛋白質結構 蛋白質純化 標簽抗體 蛋白質特異性 緩沖液
親和色譜依賴于蛋白質與基質結合配體的特異性和可逆結合。配體可以直接與感興趣的蛋白質結合，例如，用于結合 cAMP 的 PKA RIα 和 RIIβ 蛋白質的 cAMP 樹脂，或與蛋白質共價連接的標簽。親和層析是常用的蛋白質純化程序，通常用于純化方案的初始階段。根據下游應用，親和純化是獲得足夠純度重要方法。
上圖.蛋白質上的凈電荷受其溶劑 pH 值的影響。在 pH=pI 時，蛋白質的凈電荷為零，因此不會與陽離子交換或陰離子交換固定相結合。將 pH 值調整為高于或低于蛋白質的 pI 將導致凈電荷，并且蛋白質與陰離子交換 (pH > pI) 或陽離子交換 (pH < pI) 固定相結合。
用于親和層析的固定相由共價連接到配體的惰性基質制成，該配體與蛋白質或蛋白質組特異性結合。惰性基質通常由交聯的瓊脂糖或聚丙烯酰胺組成?？梢酝ㄟ^親和層析以選擇性或非選擇性方式純化蛋白質。在選擇性親和層析中，使用對蛋白質特異的配體或共價連接的標簽。在非選擇性親和層析中，例如用于免疫球蛋白的蛋白 A、G、L，或用于 DNA 結合蛋白的肝素，或用于糖蛋白的凝集素，配體與具有相似結合能力的一組蛋白質結合。例如，通過扁豆凝集素親和柱層析純化表達以生產 SARS-CoV-2 S 包膜蛋白 。
在這兩種類型的親和層析中，蛋白質在影響蛋白質（或標簽）與其配體之間結合的條件下被加載到柱子上。在不破壞特定相互作用但會破壞污染蛋白質和固定相之間的任何非特異性相互作用的條件下洗滌結合的蛋白質。然后用含有競爭分子或破壞所有蛋白質/蛋白質相互作用的條件的緩沖液洗脫結合的蛋白質。競爭分子與配體結合，取代感興趣的蛋白質。這種競爭分子通常通過另一個色譜程序或透析從感興趣的蛋白質中去除。通過破壞所有蛋白質/蛋白質相互作用從固定相洗脫蛋白質的方法包括調整緩沖液的 pH 值或離子強度。這些方法會影響蛋白質的穩(wěn)定性，建議立即中和或稀釋洗脫的蛋白質，以盡量減少蛋白質損傷。
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蛋白質純化 |
配體 |
洗脫 |
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抗體（抗原特異性） |
抗原肽 |
游離肽 |
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多組氨酸標簽蛋白 |
Ni 2+或 Co 2+ |
咪唑或游離組氨酸 |
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標記蛋白 |
FLAG 特異性抗體 |
FLAG肽或低pH |
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GST標簽蛋白 |
還原型谷胱甘肽 |
游離谷胱甘肽 |
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Myc標簽蛋白 |
Myc 特異性抗體 |
低 pH |
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抗體（特定類別） |
蛋白質 A、G 或 L 或魚精蛋白 |
極端的 pH 值 |
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DNA結合蛋白 |
肝素 |
高離子強度 |
表 1。具有用于特異性和典型洗脫條件的官能團（配體）的選擇性和非選擇性親和色譜的示例。
在設計用于蛋白質表達的質粒時，可以將親和標簽插入到 N 端或 C 端（或在少數情況下，插入具有已知結構的蛋白質的柔性環(huán)中）以幫助純化?？贵w通?；诳贵w與其抗原（抗體識別的序列）之間發(fā)生的高度特異性相互作用進行純化。可以將含有抗原的肽與基質偶聯以特異性結合抗體。降低洗脫緩沖液的 pH 值會破壞抗體/肽相互作用以釋放結合的抗體。這種方法通常在商業(yè)上用于從粗血清中分離抗體。
圖 2.離子交換色譜。蛋白質以低離子強度與帶電固定相結合。可通過增加緩沖液的離子強度或通過調節(jié) pH 值來洗脫結合的蛋白質。
蛋白質也可以以非選擇性方式進行親和純化。在非選擇性純化中，附著在固定相上的配體與具有相似結合配偶體的一組蛋白質結合。
非選擇性親和純化，比如： DNA 結合蛋白的純化。肝素在結構和電荷上都模擬 DNA，可用作親和純化 DNA 結合蛋白的配體。雖然理論上所有的 DNA 結合蛋白都可以與這個固定相結合，但大多數其他蛋白質會在沒有結合的情況下流過，從而導致感興趣的蛋白質充分富集。另一個例子是通過將抗體的恒定 (Fc) 區(qū)與配體、蛋白 A、G 或 L 結合來富集抗體。對于 IgM，可以使用魚精蛋白親和層析。
使用類似的結合模式（抗體與蛋白 A、G 或 L 配體結合），抗體的抗原結合 (Fab) 區(qū)域仍可用于與其特異性抗原結合。因此，可以基于偶聯的配體/抗體和抗體/抗原之間的特異性相互作用來純化特定的蛋白質。
常見問題和故障排除
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問題 |
原因 |
解決方案 |
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蛋白質不結合 |
標簽未翻譯或不可訪問 |
檢查質粒序列或將標簽移動到不同的位置 |
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約束條件不合適 |
調整緩沖條件 |
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沒有足夠的時間進行綁定 |
降低流速或停止色譜柱以允許孵育 |
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蛋白質不洗脫 |
配體和標簽之間的親和力非常高 |
增加競爭對手的集中度（特定）或條件的嚴格性（非特定） |
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蛋白質聚集在柱子上 |
調整緩沖液條件以獲得更高的蛋白質穩(wěn)定性 |
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低分辨率 |
流速太快或太慢 |
調整流量 |
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色譜柱未充分清洗 |
用更嚴格的緩沖液洗滌；根據制造商清潔固定相 |
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蛋白質聚集在柱子上 |
調整緩沖液條件以獲得更高的蛋白質穩(wěn)定性 |
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洗脫條件不夠嚴格 |
提高競爭對手的集中度（特定）或調整條件（非特定） |
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蛋白質在手術過程中失去活性 |
蛋白質未折疊或聚集 |
調整緩沖液條件以獲得更高的蛋白質穩(wěn)定性 |
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在純化過程中去除了活性所需的輔助因子 |
添加輔因子 |
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