細胞系的穩(wěn)定對于其廣泛應用具有重要作用。經(jīng)過細胞 轉(zhuǎn)染后的穩(wěn)定細胞系適用于重組蛋白的生產(chǎn)、基因功能研究以及藥物發(fā)現(xiàn)分析。目的基因在細胞系中穩(wěn)定表達，克服了瞬時表達轉(zhuǎn)染效率低的問題，產(chǎn)生更多的目的蛋白。

實現(xiàn)細胞系的穩(wěn)定主要有兩種途徑：一種是通過真核載體實現(xiàn)，該載體在轉(zhuǎn)染細胞的細胞核中含有用于附加體維持的元件。另一種是通過將轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒直接整合到靶細胞基因組中來實現(xiàn)。由于附加型的穩(wěn)定性比較有限，附加型質(zhì)粒元件通常僅限于某些物種，因此通常使用整合到宿主細胞染色體中。這種方法所預期的基因修飾的穩(wěn)定性通常要高得多。

產(chǎn)生穩(wěn)定細胞系的主要挑戰(zhàn)是低轉(zhuǎn)染效率和整合頻率。使用的轉(zhuǎn)染方法可能直接影響到細胞的穩(wěn)定的表達。我們知道脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法中的脂質(zhì)體試劑可用于將 DNA 轉(zhuǎn)移到貼壁細胞系中。而電轉(zhuǎn)染法主要用于難以轉(zhuǎn)染的懸浮細胞系中。但是電轉(zhuǎn)染法會受到一些限制，例如載體生產(chǎn)效率和安全問題，而而且電轉(zhuǎn)染法的細胞存活率較低

選擇標記

   為了選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞，選擇標記必須與靶蛋白共表達。標記基因可以在同一個質(zhì)粒載體或第二個共轉(zhuǎn)染載體上。有多種系統(tǒng)用于選擇轉(zhuǎn)染細胞，包括對抗生素嘌呤霉素、新霉素、DHFR 和谷氨酰胺合成酶的抗性。基因轉(zhuǎn)移后，細胞在含有選擇劑的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。只有那些含有耐藥基因的細胞才能存活。

產(chǎn)生穩(wěn)定細胞系的方法

根據(jù)實驗的范圍，有幾個選項可用于生成穩(wěn)定的細胞系。耐藥細胞的混合群體可以直接用于實驗分析，其特點是快速產(chǎn)生結(jié)果，但也有處理不確定和遺傳混合細胞群體的缺點。還有一種辦法是生成單克隆細胞系。在這種方法中，需要通過在 96 孔板中鋪板來稀釋抗性細胞，以便培養(yǎng)為單個和分離的細胞。隨后，可以重復多次克隆單細胞以獲得百分百的克隆純度。總之，根據(jù)目的表達類型和您要整合的構(gòu)建體，可以有許多不同的方法來生成穩(wěn)定的細胞系。

穩(wěn)定細胞系的形成條件

   所選細胞類型的培養(yǎng)條件（傳代、分裂節(jié)律、數(shù)量等）對于穩(wěn)定細胞系的產(chǎn)生尤為重要。正常情況下，為了促進良好的增殖和細胞生理，細胞系應在實驗前兩天進行傳代。此外，細胞通道不應高于30，因為可能會干擾集成效率。

實驗步驟如下：

1.選擇G418濃度

   由于不同細胞系之間對于 G418反應是不同的，許多細胞系會隨細胞傳代次數(shù)而發(fā)生變化。這個時候就需要通過實驗確定特定細胞類型的選擇條件（例如 G418 濃度、鋪板密度）。確定低水平的 G418 濃度，從而減少對細胞的生長的影響。需要注意的是庫存 G418 的活性濃度也可能因批次而異。因此，我們建議對每個新批次測試 G418 靈敏度。具體方法如下：

l 在板的每個孔中預板 100 μl 培養(yǎng)基。

l 在第一列 (#1) 中加入 100 μl 每孔含有 4000 個細胞的細胞懸液。

l 輕輕上下移液后，將 100 μl 移至下一列，從而以 1:2 的比例稀釋。對每個連續(xù)的列重復此過程。

l 完成后從末列 (#12) 丟棄 100 μl。第一列每孔應包含約 2000 個細胞，末列平均每孔包含約一個細胞。

l 將 100 μl 含有 G418 的培養(yǎng)基 (2.8 mg/ml) 添加到第一行 (A)，使 G418 的終濃度為 1.4 mg/ml。

l 將 G418 添加到以下行中，以逐步降低 G418 的濃度至 0.2 mg/ml。末行 (H) 添加不帶 G418 的培養(yǎng)基。

l 在標準條件下孵育細胞。

l 通過顯微鏡分析細胞生長。在某些情況下，細胞生長也可以通過培養(yǎng)基顏色的變化來觀察。

l 如果您在沒有 G418 的孔中觀察到細胞生長（10 天后），可以合理地假設這些細胞可以從單個細胞開始生長。

l 選擇略高于顯示完全細胞死亡的 G418 濃度作為適當?shù)?G418 濃度進行選擇。

2. 細胞轉(zhuǎn)染

對于轉(zhuǎn)染，可以使用轉(zhuǎn)染試劑盒將含有靶基因和耐藥基因序列的表達質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染細胞中。這個過程中盡量設置未轉(zhuǎn)染細胞的陰性對照組以進行選擇。可同時用 GFP 對照質(zhì)粒來檢查實驗的轉(zhuǎn)染效率和整合頻率。

3. 轉(zhuǎn)染后的細胞選擇

轉(zhuǎn)染后，讓細胞生長并在非選擇性條件下表達 G418 抗性蛋白約 24-48 小時（根據(jù)您的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)達到蛋白表達峰值）。

直接使用懸浮細胞或用胰蛋白酶消化貼壁細胞進行分析。在轉(zhuǎn)染后 24-48 小時通過顯微鏡或蛋白質(zhì)印跡分析您的靶蛋白和陽性對照，分析轉(zhuǎn)染效率。

通過臺盼藍染色或其他適當?shù)姆椒ㄓ嫈?shù)活細胞。

使用針對細胞類型預先測試過的標準培養(yǎng)基和適量的 G418，將細胞置于 96 孔板中，每孔具有不同的細胞數(shù)（例如，0.5、1、2、5、10），體積至少為 100 μl每孔。根據(jù)之前確定的細胞濃度，連續(xù)稀釋。在播種前徹底懸浮細胞很重要，但要避免通過頻繁移液進行苛刻的處理。

一旦出現(xiàn)未轉(zhuǎn)染的對照孔中的細胞完全死亡，就可以分析或進一步擴增細胞克隆。

4. 穩(wěn)定細胞系的分析

一旦獲得抗性細胞系，應該擴增細胞并與陽性和陰性對照比較靶基因。穩(wěn)定細胞系的分析主要包括蛋白質(zhì)印跡、顯微鏡檢查、ELISA，以及流式細胞術等方式來檢測融合蛋白的表達。

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