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Cas9基因點突變技術(shù)服務

Cas9基因點突變技術(shù)服務針對不同單堿基突變的情況使用不同的Mutation載體策略：包括短同源臂可以使用Oligo引入突變，需要長同源臂的使用ssDNA引入突變。而針對難以操作的細胞系，將需要通過先構(gòu)建Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株再進行g(shù)RNA和載體共轉(zhuǎn)染來提高效率。Cas9X針對每個具體的位點、每個具體的細胞優(yōu)化實驗條件用來滿足不同細胞系和不同位點突變的服務需求。

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Cas9基因點突變 技術(shù)服務

Cas9-Cell line Gene Mutation service（CGM）基因點突變細胞系是細胞基因研究方法中一個重要手段，它可以在細胞內(nèi)原位對點突變的功能進行研究。在細胞系上實現(xiàn)高效的轉(zhuǎn)染是實現(xiàn)基因點突變的前提；提高效率要解決問題是：Cas9切割位點與“點突變”位點之間距離導致點“點突變”效率大幅下降的問題，還有“點突變”載體的選擇問題。

目前 Cas9基因點突變 技術(shù)服務使用Cas9的引入基因“點突變”的具體實驗實踐中的“單堿基突變”的效率仍然受到很多要素的影響，例如是否在點突變附近是否存在有合適的gRNA切割位點、切割位點和突變位置之間距離、不同細胞系之間的Cas9切割活性效率差異的問題、還有細胞株是否存在“假基因”和基因“多拷貝”的問題導致無法獲得純合的問題等等。

Cas9基因點突變 技術(shù)服務針對不同單堿基突變的情況使用不同的Mutation載體策略：包括短同源臂可以使用Oligo引入突變，需要長同源臂的使用ssDNA引入突變。而針對難以操作的細胞系，將需要通過先構(gòu)建Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株再進行g(shù)RNA和載體共轉(zhuǎn)染來提高效率。Cas9X針對每個具體的位點、每個具體的細胞優(yōu)化實驗條件用來滿足不同細胞系和不同位點突變的服務需求。

Cas9 基因點突變 技術(shù)原理

基因點突變技術(shù)原理

Cas9基因點突變 技術(shù)流程

CS9技術(shù)流程

我們還能為您提供：

基因敲除細胞系服務
基因點突變細胞系服務
基因定點敲入細胞系服務
微生物基因編輯服務
基因敲除Cell Pool服務

客戶案例

| 項目名稱：

構(gòu)建Ret 基因點突變(E623K)的小鼠胚胎干細胞
| 實驗設計：
種屬：Mouse；基因名稱：Ret 突變信息：E623K（GAG to AAG）

WT序列：
gccagggcattaaagcaggctacggcatctgcaactgtttccctgatgagaagaaatgcttctgcGAGCCAGAGga
cagccagggtaagtcatgcctcccacacagttccccaacctcccctaaccctcaagggagtt
gRNA位點序列：GAAATGCTTCTGCGAGCCAGAGG

oligo序列：
ggcatctgcaactgtttccctgatgagaagaaatgcttctgcAAGCCAGAAgacagccagggtaagtcatgcctcccacacagttccccaacc

MT序列：
gccagggcattaaagcaggctacggcatctgcaactgtttccctgatgagaagaaatgcttctgcAAGCCAGAAga
cagccagggtaagtcatgcctcccacacagttccccaacctcccctaaccctcaagggagtt

備注：在E623K（GAG to AAG）基礎(chǔ)上，引入同義突變E625E (GAG to GAA)防止發(fā)生gRNA位點被再次切割。

策略圖：

基因點突變技術(shù)原理

細胞信息
種屬：Mouse；細胞名稱：胚胎干細胞

細胞檢測
無菌檢測：合格；支原體檢測：合格
細胞克隆形成率檢測：細胞增殖能力較好，克隆形成率較好。
細胞基因型檢測：針對gRNA打靶位置及其附近基因組序列進行測序, 測序結(jié)果與理論序列一致。

細胞轉(zhuǎn)導
電轉(zhuǎn)參數(shù)：1400V, 20ms, 1次；電轉(zhuǎn)體系：10 uL

PCR篩選
篩選克隆數(shù)量：185；雜合子數(shù)量：19；純合子數(shù)量：3

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