小干擾RNA（siRNA）轉染細胞是常用的基因沉默技術，以下為相關操作技巧：

一、轉染前細胞準備

- 細胞狀態(tài)：

- 細胞需處于良好生長狀態(tài)，活力要在90%以上。比如貼壁細胞，轉染前剛完成一次傳代，處于對數生長期，此時細胞代謝旺盛，攝取外界物質能力強，利于siRNA轉染。

- 要避免細胞過度密集或稀疏。細胞過于密集會使營養(yǎng)和空間不足，影響轉染效率；過于稀疏則難以檢測轉染后細胞產生的生物學效應。貼壁細胞匯合度在70 - 80%左右轉染較合適。

- 培養(yǎng)基更換：

- 轉染前需更換新鮮培養(yǎng)基，因舊培養(yǎng)基成分可能干擾轉染試劑和siRNA活性。含高濃度血清的培養(yǎng)基可能與轉染試劑結合，降低轉染試劑 - siRNA復合物形成效率，一般建議用無血清或低血清培養(yǎng)基轉染。

二、siRNA準備

- 質量檢測：

- 確認siRNA的純度和完整性，可用瓊脂糖凝膠電泳檢測是否降解，高質量siRNA電泳時應呈現(xiàn)清晰條帶，無拖尾現(xiàn)象。

- 測定siRNA濃度，其精確濃度對確定轉染試劑用量和轉染復合物比例很關鍵，通常用紫外分光光度計測其在260nm波長處吸光度來計算濃度。

- 設計優(yōu)化：

- 合理設計siRNA序列，要特異性針對目標基因，避免與其他非靶基因有較高同源性以減少脫靶效應，可借助生物信息學軟件輔助設計，設計后最好通過實驗驗證有效性。

- 對于難轉染的細胞或基因，可嘗試不同siRNA序列轉染，或采用化學修飾的siRNA提高轉染效率和穩(wěn)定性。

三、轉染試劑選擇與使用

- 選擇合適的轉染試劑：

- 依細胞類型選轉染試劑，不同細胞對其敏感性不同。例如脂質體類適用于多種細胞類型，但對某些原代細胞或難轉染細胞，可能需用陽離子聚合物類轉染試劑或病毒載體實現(xiàn)高效轉染。

- 考慮轉染試劑毒性，部分轉染試劑可能致細胞死亡或生長異常，選擇時需查閱文獻或做預實驗評估毒性。

- 優(yōu)化轉染試劑 - siRNA復合物的形成：

- 嚴格按轉染試劑說明書制備復合物，一般在無血清緩沖液中混合轉染試劑和siRNA，注意混合順序，通常先加轉染試劑入緩沖液輕輕混勻，再加siRNA，然后孵育一段時間讓復合物充分形成。

- 優(yōu)化轉染試劑和siRNA的比例，不同組合可能需不同比例達好的轉染效果，可設比例梯度實驗確定合適用量。

四、轉染過程操作

1. -加樣方式：

2. - 將轉染試劑 - siRNA復合物加入細胞培養(yǎng)孔或培養(yǎng)瓶時，要緩慢滴加，邊滴加邊輕輕晃動培養(yǎng)容器，使復合物均勻分布，避免局部濃度過高致細胞損傷或轉染不均勻。

3. - 對于貼壁細胞，盡量將復合物直接滴加到培養(yǎng)基中，不接觸細胞表面，減少對細胞的機械損傷。

4. - 轉染時間和溫度：

5. - 控制轉染時間，不同轉染試劑和細胞類型所需轉染時間不同，一般轉染復合物和細胞孵育時間在4 - 24小時之間，過長孵育時間可能增加轉染試劑毒性，過短則轉染效率低下。

6. - 注意轉染溫度，多數轉染在37°C進行，但對溫度敏感的轉染試劑或細胞，可能需在較低溫度下轉染以提高效率和細胞存活率。

五、轉染后處理

1.培養(yǎng)基更換：

- 轉染后適時更換培養(yǎng)基，若轉染試劑毒性大，轉染后4 - 6小時就應換為含血清的完全培養(yǎng)基，減少其對細胞持續(xù)傷害，但若換得過早，可能導致轉染復合物還未充分發(fā)揮作用就被移除，要依實際情況調整。

2. 檢測時間點選擇：

- 合理選擇檢測基因沉默效果的時間點，一般轉染后24 - 72小時內可檢測到目標基因表達下降，但不同基因和細胞類型會有差異，可用實時定量PCR或Western blotting等方法檢測基因沉默效果。
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