怎么用Nanodrop 測(cè)定雙鏈RNA濃度？

使用Nanodrop光度計(jì)測(cè)定雙鏈RNA（dsRNA）的濃度是一個(gè)簡(jiǎn)單的過(guò)程，但需要正確的方法和適當(dāng)?shù)膶?duì)照。

以下是一般步驟：

1.準(zhǔn)備工作：

確保樣品清潔：確保您的dsRNA樣品沒(méi)有蛋白質(zhì)或其他污染物，因?yàn)檫@些可能會(huì)干擾測(cè)量。

使用無(wú)RNAase的管和工具：在整個(gè)過(guò)程中使用無(wú)RNAase的管和工具，以避免RNA的降解。

2.Nanodrop操作步驟：

• l 開(kāi)機(jī)并校準(zhǔn)Nanodrop：
• l 打開(kāi)Nanodrop光度計(jì)，并確保其已經(jīng)校準(zhǔn)并且溫度穩(wěn)定。
• l 設(shè)置測(cè)量程序：
• l 在Nanodrop軟件中選擇“RNA”模式，因?yàn)閐sRNA的測(cè)量與單鏈RNA類似。
• l 準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品（可選，用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線）：
• l 如果您有已知濃度的RNA標(biāo)準(zhǔn)品，可以準(zhǔn)備一系列稀釋液，用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，以更準(zhǔn)確地確定未知樣品的濃度。
• l 測(cè)量dsRNA樣品：
• l 將dsRNA樣品稀釋（如果必要的話），通常使用無(wú)RNAase的水或TE緩沖液。
• l 使用無(wú)RNAase的槍頭，將稀釋后的樣品直接滴入Nanodrop的測(cè)量槽中。
• l 關(guān)閉測(cè)量槽蓋子，確保沒(méi)有氣泡。
• l 在軟件中，選擇“Measure”來(lái)開(kāi)始測(cè)量。
• l 讀取結(jié)果：
• l Nanodrop軟件會(huì)顯示吸光度（A）值，特別是260納米（A260）的吸光度。
• l 記錄A260的吸光度值，并檢查A260/A280和A260/A230的比值，以評(píng)估樣品的純度。

對(duì)于dsRNA，理想的A260/A280比值通常在1.8到2.0之間。A260/A230比值應(yīng)該大于1.5。

3.計(jì)算濃度：

如果您沒(méi)有使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以使用以下公式計(jì)算dsRNA的濃度：

 這里的40是一個(gè)常數(shù)，代表每微克/毫升單鏈RNA在260納米的吸光度。對(duì)于雙鏈RNA，這個(gè)常數(shù)可能略有不同，通常在33-37之間，具體取決于dsRNA的堿基組成和結(jié)構(gòu)。建議使用制造商提供的具體數(shù)值或通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品確定該值。

4.重復(fù)測(cè)量：

為了確保準(zhǔn)確性，可以對(duì)每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量幾次，并計(jì)算平均值。

5.注意事項(xiàng)：

• l 確保在測(cè)量前將dsRNA樣品充分混勻。
• l 避免氣泡和樣品污染，這些都可能影響測(cè)量結(jié)果。
• l 如果樣品的A260/A280或A260/A230比值不理想，可能需要進(jìn)一步純化樣品。
• l 使用Nanodrop光度計(jì)時(shí)，請(qǐng)務(wù)必參考設(shè)備的操作手冊(cè)和制造商的建議，以確保獲得最準(zhǔn)確和可靠的結(jié)果。

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