聚合酶鏈式反應（PCR）作為一種強大的分子生物學技術，在生命科學研究、醫(yī)學研究、法醫(yī)學等眾多領域都發(fā)揮著至關重要的作用。深入了解 PCR 反應體系與反應條件，對于準確、高效地進行實驗 非常重要。

一、標準的 PCR 反應體系

標準的 PCR 反應體系包含多個關鍵成分。主要有：

10×擴增緩沖液，它為反應提供穩(wěn)定的化學環(huán)境。4 種 dNTP 混合物，即脫氧核糖核苷三磷酸（包括 dATP、dCTP、dGTP、dTTP），各以 200umol/L 的濃度存在于體系中，為 DNA 合成提供原料。引物是 PCR 特異性反應的關鍵，各 10～100pmol 的引物決定了擴增的起始位置和方向。模板 DNA 的量通常在 0.1～2ug 之間，它是待擴增的目標 DNA 片段。Taq DNA 聚合酶以 2.5u 的量參與反應，催化 DNA 合成。Mg2+濃度為 1.5mmol/L，它對 PCR 反應的特異性和產量有顯著影響。最后，通過加入雙或三蒸水將反應體系調整至 100ul。

二、PCR 反應五要素

PCR 反應主要由五種物質組成，即引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+。

引物是決定 PCR 特異性的關鍵因素。其長度通常在 15 - 30bp 之間，20bp 左右較為常用。合適的引物長度有助于確保特異性結合和高效擴增。引物擴增跨度以 200 - 500bp 為宜，這樣可以在保證特異性的同時，實現(xiàn)對目標片段的有效擴增。引物堿基中 G + C 含量以 40 - 60%為宜，ATGC 最好隨機分布，避免出現(xiàn)連續(xù)的 5 個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸成串排列，以減少非特異性結合的風險。同時，要避免引物內部出現(xiàn)二級結構以及兩條引物間互補，防止形成引物二聚體。引物 3`端的堿基應嚴格要求配對，否則可能導致 PCR 失敗。

此外，引物中有或能加上合適的酶切位點，對于后續(xù)的酶切分析或分子克隆非常有好處。并且引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性，以確保特異性。引物濃度也需謹慎控制，以最低引物量產生所需要的結果為好，濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，還會增加引物之間形成二聚體的機會。

酶在 PCR 反應中起著核心作用。目前主要有兩種 Taq DNA 聚合酶供應，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反應約需酶量 2.5U（指總反應體積為 100ul 時），濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。

dNTP 即脫氧核糖核苷三磷酸，在 PCR 反應中為 DNA 合成提供原料。dNTP 粉呈顆粒狀，保存不當易變性失去生物學活性。應配成高濃度后，以 1M NaOH 或 1M Tris.HCL 的緩沖液將其 PH 調節(jié)到 7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。在 PCR 反應中，dNTP 應為 50～200umol/L，并且 4 種 dNTP 的濃度要相等，任何一種濃度不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會引起錯配。濃度過低會降低 PCR 產物的產量，而濃度過高又會與 Mg2+結合使游離的 Mg2+濃度降低。

模板 DNA 是 PCR 反應的目標。傳統(tǒng)的 DNA 純化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 來消化處理標本，提取的核酸即可作為模板用于 PCR 反應。對于一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用于 PCR 擴增。RNA 模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶 K 法，同時要特別注意防止 RNase 降解 RNA。

Mg2+對 PCR 擴增的特異性和產量有較大影響。在一般的 PCR 反應中，各種 dNTP 濃度為 200umol/L 時，Mg2+濃度為 1.5～2.0mmol/L 為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增；濃度過低會降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反應產物減少。

三、PCR 反應條件設置

PCR 反應基于原理三步驟而設置變性 - 退火 - 延伸三個溫度點。對于較短靶基因可采用二溫度點法。

變性是 PCR 反應的一步驟，其目的是使雙鏈 DNA 解鏈為單鏈。變性溫度一般為 93℃～94℃，時間為 1min。變性溫度低，解鏈不完全是導致 PCR 失敗的最主要原因。但溫度也不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。

退火是第2步，在這一步引物與模板發(fā)生結合。退火溫度取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于 20 個核苷酸，G+C 含量約 50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。退火溫度可通過公式 Tm 值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)，復性溫度=Tm 值-(5～10℃)來幫助選擇合適的溫度。在 Tm 值允許范圍內，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高 PCR 反應的特異性。復性時間一般為 30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。

接下來是延伸，在 Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。延伸溫度一般選擇在 70～75℃之間，常用溫度為 72℃。過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。延伸時間可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般 1Kb 以內的 DNA 片段，延伸時間 1min 是足夠的。3～4kb 的靶序列需 3～4min；擴增 10Kb 需延伸至 15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。

總之，準確理解和掌握 PCR 反應體系與反應條件，對于成功進行 PCR 實驗至關重要。只有在合適的反應體系和條件下，才能實現(xiàn)高效、特異性的 DNA 擴增，為后續(xù)的研究和應用提供可靠的基礎。   

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